地铁S3号线途经江宁区、雨花台区、建邺区和浦口区，线路东起南部新城的南京南站，一路向西经过雨花经济开发区北部、铁心桥地区、河西新城南部，行驶大胜关长江大桥专用过江通道跨越长江，进入桥林新城，西至高家冲站，是中国唯一一条在桥上与高铁并行的地铁线路。
为：迈皋桥站、红山动物园站、南京站、新模范马路站、玄武门站、鼓楼站、珠江路站、新街口站、张府园站、三山街站、中华门站、安德门站、天隆寺站、软件大道站、花神庙站、南京南站。
南京地铁一号线的运营时间为早上6:00到晚上22:00，区间运营时间为每小时6个班次，高峰期为每小时7个班次。
早晚高峰期间，南京地铁一号线的客流量较大，可能需要乘客做好等车、换乘的充分准备。